Амплификация ДНК. Клонирование генов

Чтобы ввести в организм гены, сначала необходимо получить их в достаточном количестве. Итак, первый шаг в опытах по генетической инженерии — получение и клонирование генетического материала.

Клонирование генов

В обычном понимании клоном считается идентичная копия высшего организма, например всемирно известная и ныне покойная овечка Долли. Молекулярные биологи, однако, клоном считают популяцию генетически идентичных (за исключением мутаций, происходящих во время клонирования) организмов, клеток, вирусов или молекул ДНК.

Для получения клона вируса необходимо заразить одну клетку одним вирионом. Все образующиеся вирионы, произведенные зараженной клеткой, будут клонами исходного вириона. Поскольку эти клоны могут заражать новые клетки, то очень быстро можно получить множество копий исходного вириона. Они выглядят как отдельные ясные пятна (бляшки), вызванные гибелью зараженных клеток, на слое (газоне) незараженных клеток в чашке Петри.

Вы можете клонировать клетку, просто выращивая ее на слое ростовой среды (обычно агара — вещества, приготовленного из морских водорослей). Бактериальные клетки, как и клетки млекопитающих, легко клонируются таким образом.

Однако целью клонирования, с точки зрения изучения ДНК, является не получение идентичных копий нормальной клетки, а получение большого количества определенного фрагмента ДНК.

В генетической инженерии цель клонирования, как правило, — получение значительного количества копий специфического гена. Этот ген сообщает клетке функцию, которую вы хотите получить в генетически модифицированном организме.

Прежде чем получить множество копий гена, его нужно сначала отделить от остального генома. Первый шаг на этом пути — создание библиотеки, в которой ДНК генома разбита на куски. Если удача сопутствует вам, то ген, который вы ищете, будет расположен на одном из таких кусков.

Библиотека в данном случае ничего общего с книгами не имеет. Скорее, это коллекция фрагментов ДНК, выделенных из одного источника, коллекция клонов.

Для создания библиотеки понадобится вектор. Какая-нибудь молекула ДНК, в которую вы сможете встроить новую ДНК и внести ее в хозяйскую клетку, чтобы она могла реплицировать ее. Самыми распространенными векторами являются плазмиды (мы рассматривали их в главе 9). Также векторами могут служить фаги (рассмотренные в главе 11).

Выбор вектора для клонирования

Не только вирус или плазмида могут использоваться как векторы. Идеальный вектор для генетической инженерии должен иметь три характеристики.

1. Хороший потенциал клонирования. То есть должен давать большое количество реплик в хозяйской клетке.

2. Его геном должен иметь один сайт узнавания для каждого из многих ферментов рестрикции. Таким образом, чужой ген сможет встраиваться только в одну точку вектора.

3. Он должен иметь полезную функцию в клетке, например нести ген устойчивости к антибиотику, чтобы можно было легко отличить клетки, несущие вектор, и выделить встроенный в него ген.

ДНК генома из донорского организма разрезается на множество фрагментов ферментами рестрикции, которые также разрезают ДНК-плазмиды в одном месте. Фрагменты геномной ДНК и разрезанной ДНК-плазмиды смешивают. Их липкие концы соединяются друг с другом, в основном, случайно. В результате образуется множество различных плазмид, каждая из которых несет фрагмент донорской ДНК, все они вместе (надо надеяться) содержат совокупную ДНК генома донора.

Эти плазмиды вводятся в клетки бактерий-реципиентов (клетки становятся проницаемыми для чистой плазмидной ДНК при обработке их холодным раствором хлорида кальция). Трансформированные бактериальные клетки распределяют тонким слоем по агару, так что каждая клетка может размножаться отдельно от остальных.

Плазмида, используемая в качестве вектора, обычно несет гены устойчивости к двум антибиотикам. Исследователи пользуются ферментом рестрикции, чтобы разрезать ДНК плазмиды в одном из этих генов. Любая бактерия, не несущая плазмид, гибнет от каждого из двух антибиотиков. Бактерии, получившие плазмиды без клонированного в них чужого фрагмента ДНК, выживают на агаре с каждым из двух антибиотиков. А вот клетки, несущие плазмиды, в которые встроена чужеродная ДНК, будут расти на агаре только с антибиотиком, ген устойчивости к которому не был разрушен ферментом рестрикции (рис. 12.2). Эти клетки, у которых чужой ген встроен в ген устойчивости ко второму антибиотику, сформируют колонии, или клоны. Все клетки в каждой колонии будут нести множество копий исходной ДНК, но каждая из них будет также содержать копию нового, чужеродного фрагмента ДНК.

Использование плазмидного вектора с двумя генами устойчивости к антибиотикам облегчает создание библиотеки

Рис. 12.2. Использование плазмидного вектора с двумя генами устойчивости к антибиотикам облегчает создание библиотеки

Такая же методика применяется для вирусных или фаговых векторов.

Однажды созданные библиотеки хранятся как постоянный источник ДНК для клонирования (почему, собственно, их и называют библиотеками ).

Библиотеками часто пользуются, чтобы выделить определенные гены. Есть два пути поиска специфических клонов в библиотеке, которые несут фрагменты ДНК с последовательностями нужного гена. Один путь заключается в поиске специфической последовательности оснований этого гена (если она известна). Другой путь состоит в поиске специфического белка, кодируемого геном. В любом случае, поиск называется скринингом. Есть много методов скрининга, зависящих от используемого вектора и гена, который предстоит найти.

Пример поиска гена, для которого известна последовательность оснований ДНК, приведен на рис. 12.3.

Один из методов поиска (скрининга) клонов с определенной последовательностью ДНК

Рис. 12.3. Один из методов поиска (скрининга) клонов с определенной последовательностью ДНК

Колонии бактерий или бляшки фага с агара на чашках Петри переносят на твердый диск, обычно из целлюлозы, очень простой методикой. Диск кладут на агар, потом поднимают. Колонии и бляшки остаются на месте, но достаточное для анализа количество материала переносится с них на нитроцеллюлозу диска.

Затем ДНК на диске расплетается за счет помещения его в химический раствор, содержащий однонитевую ДНК или РНК, комплементарные одной из нитей клона и меченные радиоактивными атомами. Меченая нить называется пробой.

В местах соединения пробы с одной из рекомбинантных нитей она оставляет меченые атомы, которые могут регистрироваться на фотографической пленке. Эти места полностью соответствуют местам расположения клонов на агаре в чашке Петри.

Если последовательность ДНК разыскиваемого гена неизвестна, можно использовать другой метод скрининга. Он основан на создании клонов с использованием векторов, позволяющих выражаться генам, которые на них распложены, в новых хозяйских клетках. Клетки начинают продуцировать белок, кодируемый геном, а исследователям остается искать в библиотеке белок нужного гена.

Как только место расположения клона найдено, клон можно снять с агара микробиологической петлей и размножить. Рекомбинантная ДНК легко выделяется из клона и очищается, а клетки клона, продуцирующие ее, длительное время размножаются и хранятся в лаборатории. Все это обеспечивает генным инженерам неограниченное поступление материала нужного гена для его встройки в другие организмы.

Необходимо купить сирену для дома, чтобы обезопасить себя и свою семью от непрошенных гостей.

Оставить комментарий

Ваш комментарий