Днк-пробы, гибридизация и саузерн-блоттинг

Основным методом выявления последовательности оснований в цепочке ДНК является ядерная проба, или ДНК-проба. В основе этого метода лежит стремление одноцепочечной ДНК соединяться с цепочками ДНК, имеющими последовательности, комплементарные последовательностям исходной цепочки. Если вы ищете последовательность А-Т-Ц-Г-Г, то будете использовать пробу, содержащую последовательность Т-А-Г-Ц-Ц. Образующуюся в результате двойную цепь ДНК называют гибридной, потому что она представляет собой сочетание «натуральной» ДНК и «искусственной» ДНК-пробы. Стадия гибридизации представляет собой простое смешивание одноцепочечных проб с целевой ДНК.

Сначала необходимо денатурировать ДНК. Денатурация ДНК происходит при ее нагревании. При этом двойная цепь разъединяется на две цепочки, что позволяет одноцепочечным пробам найти комплементарные участки и соединиться с ними.

Применение ядерной пробы часто совмещают с методом анализа фрагментов ДНК, называемым Саузерн-блоттинг. Этот метод назван в честь его разработчика, Эдварда Саузерна (Edward Southern). Благодаря человеческой природе мы теперь имеем Нозерн-блоттинг, применяемый для анализа РНК, и Вестерн-блоттинг, используемый для анализа белков. Будущие поколения, несомненно, будут недоумевать по поводу этих названий.

Southern в переводе с английского означает «южный», Northern – «северный», Western – «западный». – Прим. перев.

Для Саузерн-блоттинга нужно сначала разделить исследуемый участок ДНК на небольшие фрагменты. Чтобы разрезать ДНК, вы снова будете использовать уже знакомые рестриктазы. Вы сможете определить последовательность ДНК по сайтам, где происходит разрезание цепи. Образовавшиеся фрагменты ДНК затем подвергают гель-электрофорезу. Электрофорез — это аналитический метод разделения молекул, основанный на различиях в их размере и/ или электрическом заряде. При воздействии электрического тока, пропускаемого через гель, исследуемые соединения перемещаются в геле. Скорость, с которой молекулы передвигаются, зависит от величины их заряда: они реагируют на электрическое поле в зависимости от того, насколько сильно заряжены. Скорость передвижения молекул также зависит от их размера. Небольшим соединениям легче передвигаться в геле, чем большим. Различные фрагменты анализируемой ДНК вы помещаете на одном конце геля в специально предназначенные для этого карманы. Каждый фрагмент — в отдельном кармане. Затем включаете электрический ток. Результат вы можете увидеть на рис. 7.10.

Гель-электрофорез

Рис. 7.10. Гель-электрофорез

Вы ничего не видите? Конечно, ведь необходимо сделать что-то еще, чтобы увидеть фрагменты ДНК. Погрузите гель в этидиум бромид (EtBr) — флуоресцентный краситель, который связывается с ДНК. Когда вы посмотрите на гель в ультрафиолетовом свете определенной длины волны, то увидите фрагменты ДНК, как показано на рис. 7.11. Вот так!

Визуализация ДНК с помощью этидиум бромида

Рис. 7.11. Визуализация ДНК с помощью этидиум бромида

Как же насчет пробы? Этидиум бромид показал все фрагменты, но вам необходимо знать, какой фрагмент связался с пробой. К счастью, вы все продумали заранее и снабдили пробу радиоактивной или флуоресцентной меткой. Один из способов обнаружения нужных молекул — система соединенных антител и флуорохромов. Этот метод получил название флуоресцентной in situ гибридизации. Можно синтезировать пробы с встроенными флуоресцентными молекулами или молекулами, которые определяются с помощью флуоресцентных антител. Таким образом, становится возможной прямая визуализация проб.

В любом случае вы высушите гель на системе фильтров, чтобы обеспечить твердую основу для образцов при дальнейшем анализе. Если вы пометили фрагменты ДНК с помощью радиоактивных атомов, например трития, нужно положить фоточувствительную пленку на основу, и радиоактивный элемент проявит пленку так же, как это происходит при воздействии света на фотопленку. Если вы пометили фрагмент ДНК с помощью флуоресцентной метки, то будете экспонировать основу в ультрафиолетовом свете определенной длины волны. Очевидно, вам понадобится метка, которая требует для своего выявления иную длину волны, чем этидиум бромид. В любом случае вы увидите нечто похожее на изображение на рис. 7.12.

Локализация пробы ДНК.

Рис. 7.12. Локализация пробы ДНК.

Применяя этот анализ, вы узнаете о локализации специфичных последовательностей ДНК благодаря использованию определенных рестриктаз, а также о локализации последовательности оснований, комплементарной пробе во фрагменте ДНК.

газель термобудка
Патрубки бронзовые. Чугунные патрубки www.nordmile.ru.

Оставить комментарий

Ваш комментарий