Ферменты рестрикции

Нуклеазы — это ферменты, разрывающие связи, которые скрепляют нуклеотиды в цепи, дезоксирибонуклеазы атакуют молекулы ДНК, а рибонуклеазы атакуют молекулы РНК (особенно однонитевые). Некоторые нуклеазы удаляют по одному нуклеотиду с концов нуклеотидной цепи, они называются экзоназы. Ферменты, которые разрезают остов молекул ДНК и РНК во всех других местах, кроме концов, называются эндонуклеазами.

Бойер сфокусировал свою работу на особом типе нуклеаз, называемых эндонуклеазами рестрикции, в частности, на эндонуклеазах типа II (есть еще эндонуклеазы рестрикции типа I и типа III). Ферменты типа II узнают основание в последовательности двунитевой ДНК, в точке, называемой сайтом рестрикции, и связываются с ним, а разрезают остов каждой нити за 20 оснований от данного сайта (рис. 12.1).

Ферменты рестрикции разрезают длинную молекулу ДНК на фрагменты в зависимости от сайтов узнавания. Полученные в результате фрагменты обладают «липкими концами» — несколькими неспаренными основаниями

Рис. 12.1. Ферменты рестрикции разрезают длинную молекулу ДНК на фрагменты в зависимости от сайтов узнавания. Полученные в результате фрагменты обладают «липкими концами» — несколькими неспаренными основаниями

Типичный сайт рестрикции состоит из четырех-восьми оснований, которые следуют друг за другом непрерывно (например, ГААТТЦ) или прерываются (например, ГТХХАЦ, где на месте X могут стоять любые основания). Последовательность симметрична, то есть ее можно точно так же прочитать (но в противоположном направлении) на другой нити ДНК. В приведенных примерах на противоположной нити последовательности читаются как ЦТТААГ и ЦАХХТГ. Эта симметрия делает комплементарные основания палиндромом.

Ферменты рестрикции обычно встречаются у бактерий, где они помогают отразить нападение вирусов. Сайты узнавания в бактериальной ДНК модифицируются добавлением к ним метальной группы (—СНЗ) в процессе метилирования, который выполняется ферментами, называемыми (как же еще?) метилазами. Метилирование не позволяет ферментам рестрикции разрезать геном в сайтах рестрикции. А вот геномы вирусов, у которых сайты рестрикции не модифицированы, могут быть разрезаны ферментами рестрикции и разрушены. Совокупность указанных процессов называется системой рестрикции и модификации.

Классификация ферментов рестрикции

Ферменты рестрикции называются по имени вида бактерий, которые их продуцируют. Обычно название начинается с трех букв. Первая, заглавная, — это первая буква названия рода бактерий, а вторая и третья — первые буквы названия вида. Они выделяются курсивом (потому что научные названия традиционно пишутся курсивом). За тремя буквами следуют три римские цифры (не выделенные курсивом), чтобы показать, какой из типов фермента выделен из этого вида бактерий.

Если фермент выделен из специфического штамма бактерий, то четвертая буква указывает на название штамма (она не выделяется курсивом). Несколько примеров:

  • PstII — второй фермент, выделенный из Providentia stuertii;
  • EcoRI — первый фермент, выделенный из E. coli, штамма RY13;
  • HindIII — третий фермент, выделенный из Haemophilus influenzae, штамма Rd.

Ферменты рестрикции привлекли внимание Бойера и других ученых, потому что их использование давало метод для расщепления очень длинной нити ДНК на куски заранее определенной длины, с которыми оказалось гораздо легче работать. Ферменты рестрикции делают и еще кое-что полезное: они оставляют на концах разрезанного фрагмента ДНК короткую последовательность неспаренных оснований. Например, Бойер особенно интересовался ферментом EcoRI, который с одного конца фрагмента ДНК оставлял ТТАА, а с другого конца — ААТТ.

Следовательно, любой фрагмент ДНК, разрезанный специфическими ферментами рестрикции, мог быть соединен с любым другим фрагментом, разрезанным этим же ферментом рестрикции, потому что фрагменты имеют «липкие концы». После этого фермент лигаза мог сшить фрагменты друг с другом.

Во время дискуссии в Гонолулу Бойер и Коен поняли, что, объединив силы, смогут сделать то, чего никто и никогда раньше не делал: напрямую сконструировать геном организма.

узнать реклама сайта Жми
Задвижка с электроприводом auma teplosity.ru.

Оставить комментарий

Ваш комментарий