Искусственные хромосомы

Плазмиды слишком малы, чтобы переносить большой генетический материал, а вирусные векторы, как мы только что обсуждали, трудно контролировать. Эти проблемы с векторами можно было бы решить, если бы мы могли создавать хромосомы с необходимым генетическим материалом. Эти хромосомы сосуществовали бы с естественным генетическим материалом клетки таким же образом, как ДНК митохондрий.

Ученые обнаружили, что двухцепочечная ДНК с теломерами на концах, центромерой и сайтами связывания ДНК-полимеразы для репликации будет вести себя в клетке, как хромосома. Это открытие позволило создать искусственные хромосомы. Как вы помните, теломеры состоят из плотных участков ДНК и белков на концах хромосом и служат для защиты хромосом от повреждения. Центромеры — это особые участки ДНК, необходимые для контроля распределения хромосом во время деления клетки. Наличие центромеры и сайтов связывания ДНК-полимеразы позволит ДНК искусственной хромосомы реплицироваться наравне с ДНК клетки-хозяина.

Наиболее широко используются бактериальные искусственные хромосомы, созданные в 1992 году. Они основаны на естественных бактериальных структурах: имеют бактериальные теломеры и центромеру. Наиболее популярной структурой, которую берут за основу бактериальной искусственной хромосомы, является f-плазмида (сокращение «f» происходит от английского слова «fertility», что означает изобилие, плодовитость, богатство) Escherichia coli. Система использования бактериальной искусственной хромосомы позволяет ввести в клетку намного больший участок ДНК по сравнению с тем, который можно ввести, используя традиционные методы создания рекомбинантной ДНК. В бактериальную искусственную хромосому можно вместить до 300 тыс. пар оснований. Затем она вводится в клетку путем электропорации, когда серия электрических импульсов стимулирует образование пор в клеточной мембране.

Бактериальные искусственные хромосомы достаточно стабильны в бактериальном геноме. Это объясняет, почему их удобно использовать для установления последовательности генов в бактериальном генетическом материале. Когда бактерии растут и размножаются, бактериальные искусственные хромосомы в них реплицируются. В результате образуется колония генетически идентичных клеток, каждая из которых содержит копию нужной вам ДНК. Таким образом, необходимая ДНК амплифицируется и может быть изолирована от остальной ДНК внутри клетки. В проекте «Геном человека» (см. ниже) многочисленные фрагменты человеческого генома были внедрены в бактериальные искусственные хромосомы и размножены перед установлением последовательности ДНК.

Были также созданы искусственные хромосомы, в основе которых лежала структура хромосом организмов, отличных от бактерий. Искусственная дрожжевая хромосома была впервые создана в 1987 году Дэвидом Берком (D. Burke). Искусственная дрожжевая хромосома имеет теломеры, центромеру и элементы, участвующие в репликации. Инженерная искусственная дрожжевая хромосома вводится в клетку с помощью химических методов, которые индуцируют клетку поглощать генетический материал. Синтетическая хромосома остается независимой от другого генетического материала в клетке-хозяине и функционирует исключительно как дополнительная хромосома. Преимущество искусственной дрожжевой хромосомы перед бактериальной искусственной хромосомой состоит в том, что первая может нести в себе намного больший фрагмент ДНК, до 1 млн пар оснований. Кроме того, дрожжи намного более устойчивы к чужеродной ДНК, содержащей высокоповторяющиеся последовательности (как в случае ДНК человека). Недостатком искусственной дрожжевой хромосомы является ее меньшая стабильность по сравнению с бактериальной искусственной хромосомой. Кроме того, процесс выделения клонированной ДНК сложнее. Тем не менее искусственные дрожжевые хромосомы находят более широкое применение на ранних этапах исследования генома.

В 1997 году исследователи School of Medicine and Athersys, Inc. создали первые искусственные человеческие хромосомы. Но за этим не последовало создания различных искусственных человеческих хромосом и их внедрения в клетку человека. Человеческие центромеры состоят из больших участков высокоповторяющейся ДНК, которые называются альфа-сателлитной ДНК. Ученые синтезировали альфа-сателлитную ДНК и затем ввели полученный материал центромер в клетку вместе с теломерами и кодирующими последовательностями. Внутри клетки эти независимые элементы собрались в миниатюрные хромосомы, называемые синтетическими микрохромосомами. Для новых микрохромосом была показана нормальная экспрессия генов на всех этапах клеточного цикла, то есть были синтезированы новые белки. Клиническое применение искусственных хромосом могло бы предотвратить риск внедрения вирусных векторов, включая возможное повреждение хромосом или нарушение нормальной экспрессии, когда новый генетический материал встраивается в существующий геном. Тем не менее разработка условий, в которых пациенты могли бы пройти процедуры, необходимые для создания искусственных хромосом in situ, пока еще только предстоит.


Оставить комментарий

Ваш комментарий