Метод Сэнджера

Метод Сэнджера используется с самого своего открытия в 1977 году для определения последовательности оснований в ДНК. Этот хитроумный метод определения расположения специфического основания во фрагменте ДНК также называется «методом обрыва цепи», потому что основан на остановке синтеза новой цепочки ДНК. Принцип данного метода зависит от двух фактов: (а) синтез фрагмента двуцепочечной ДНК из одноцепочечной цепочки ДНК инициируется в присутствии ДНК-полимеразы; (б) синтез ДНК останавливается, если включенное в цепочку основание находится в форме дидезоксинулеотида вместо дезоксинулеотида. В дидезокси-форме нуклеотида отсутствует гидроксильная группа в определяющей позиции (3′-позиция) — рис. 7.13.

Использование дидезоксинуклеотидов, чтобы прервать синтез ДНК

Рис. 7.13. Использование дидезоксинуклеотидов, чтобы прервать синтез ДНК

Поэтому, если вы снабдите синтезирующуюся молекулу ДНК, к примеру, дидезоксиаденозином (ддАТФ) в смеси с дезоксиаденозином (дАТФ) и другими тремя дезоксинуклеотидами, то синтез второй цепочки остановится там, где в цепочку встроится дидезоксиаденозин вместо дезоксиаденозина. По теории вероятности в части синтезируемых ДНК репликация прервется в каждой точке, где необходим аденозин.

Метод Сэнджера использует дидезоксинуклеотиды для всех четырех нуклеотидов. Есть четыре набора реагентов, каждый из которых содержит все четыре нуклеотида в нормальной дезокси-форме и один из нуклеотидов в дидезокси-форме. Копии одной и той же одноцепочечной ДНК инкубируют в каждом наборе. В каждом из четырех наборов синтез ДНК останавливается по всем соотвествующим сайтам фрагмента ДНК. Электрофорез проводится во всех четырех наборах раздельно. Поскольку длина пути передвижения в геле при электрофорезе зависит от размера молекулы, фрагменты ДНК будут распределяться линейно в соответствии со своим размером. Если взять, например, набор с ддАТФ, то мы увидим, что в образце будут присутствовать фрагменты ДНК, укороченные по каждой из позиций, где в синтезируемой цепи находился аденозин. Некоторые фрагменты, в цепи которых аденозин появляется рано, будут короткими. Другие (аденозин появляется позже в последовательности ДНК) — длиннее. Вы можете определить локализацию аденозина по длине этих фрагментов. Затем можно сравнить данные, полученные после электрофореза в каждом наборе. Так вы определите локализацию каждого нуклеотида в исследуемой последовательности ДНК (рис. 7.14).

Определение последовательности ДНК с использованием метода Сэнджера

Рис. 7.14. Определение последовательности ДНК с использованием метода Сэнджера


Оставить комментарий

Ваш комментарий