Отбор трансформированных бактерий

Теперь вы получили неоднородную популяцию бактерий: часть содержит плазмиды с геном инсулина, часть — плазмиды с генами, кодирующими другие белки, а некоторые — плазмиды, не содержащие новых генов. У остальных бактерий процесс трансформации не произошел вообще. Вам необходима субпопуляция бактерий, которые содержат плазмиду с нужным вам геном.

Вы можете устранить бактерии, которые не включили никаких плазмид, выращивая их в среде, где они не могут выжить без гена, содержащегося в плазмиде. Вспомним, что плазмиды часто содержат гены, ответственные за выживание в экстремальных условиях среды. Типичными генами плазмид являются гены устойчивости к антибиотикам и металлам. Вы можете выбрать бактерии, чувствительные к ампициллину, и вставить плазмиды, которые содержат бактериальный ген, обеспечивающий устойчивость к ампициллину. Если после трансформации вы будете культивировать бактерии на среде, содержащей ампициллин, выживут только бактерии, которые включили плазмиды. Так вы избавитесь от бактерий, у которых процесс трансформации не прошел (рис. 7.5). Это шаг 7 на рис. 7.8.

Рис. 7.5. Удаление бактерий, не включивших плазмиду

Рис. 7.5. Удаление бактерий, не включивших плазмиду

Теперь вы отобрали бактерии, у которых успешно прошел процесс трансформации. Следующим шагом будет отбор бактерий, которые включили плазмиды, не содержащие нового генетического материала, чтобы исключить их из дальнейшего процесса, так как ваша цель — найти лишь бактерии, которые трансформированы нужным вам геном. Как вы помните, можно выбирать место вставки гена в плазмиду, так как вы знаете последовательность нуклеотидов и выбрали рестриктазу, которая разрезает плазмиду в определенном месте. Вы можете выбрать способ, чтобы прервать последовательность геном, наличие которого определяется в культуре. Одна из часто применяемых систем — бета-галактозидаза. Этот фермент взаимодействует с веществом, называемым X-gal (5-бромо-4-хлороиндолил-галактозид), с появлением синей окраски. Если вы сконструируете систему, в которой плазмиды содержат генную вставку в середине гена бета-галактозидазы, то данный ген не сможет нормально функционировать. Вы сможете увидеть бактерии, которые содержат генную вставку, потому что они не будут окрашиваться в синий цвет в присутствии X-gal в среде. Ген бета-галактозидазы называют репортерным, потому что он «сообщает» (от английского «report») о состоянии плазмидной ДНК. Вы можете культивировать бактерии на агаре, содержащем X-gal. Колонии с геном бета-галактозидазы будут окрашивать агар в синий цвет. Вам же нужны колонии, не окрашивающие агар в синий цвет (рис. 7.6). Это шаг 8 на рис. 7.8.

Теперь вы сузили популяцию бактерий до образцов, включивших плазмиды с новым генетическим материалом. Исходной целью было получить популяцию бактерий, образующих человеческий инсулин. Теперь нужно найти бактерии, в которых есть ген инсулина. Не весь новый генетический материал кодирует инсулин. Как вы помните, мРНК выделилась из островковых клеток. Большинство полученной мРНК будет кодировать инсулин, но часть — другие белки.

Рис. 7.6. Отбор бактерий с нужной плазмидой

Рис. 7.6. Отбор бактерий с нужной плазмидой

Необходимо иметь возможность отличить колонии, которые продуцируют инсулин. Вы можете пометить инсулин-продуцирующие клетки с помощью моноклональных антител. Моноклональные антитела были подробно описаны в главе 5. Они специфичны к определенному белку или его части. Возможность получать моноклональные антитела — важное преимущество при диагностике во время биомедицинских исследований, потому что эти антитела очень специфичны, и вы можете присоединить к ним метку. Эта метка не будет влиять на способность антител связываться с антигеном. Вы можете получить антитела против инсулина и пометить их тем или иным способом, например присоединить к антителам краситель, который будет флуоресцировать при связывании в клетках, содержащих инсулин. Другой возможной меткой могут служить радиоактивные молекулы, включенные в состав антитела, например радиоактивный водород, известный как тритий. Молекулы трития включаются в состав антител, замещая нерадиоактивный водород в молекулярной структуре антитела. Присутствие трития можно обнаружить, поместив фотопленку над исследуемым материалом. Радиоактивное излучение от трития проявит пленку, как это делает, например, свет.

Моноклональные антитела к инсулину должны проникнуть внутрь клетки, чтобы связаться с ним. Можно разрушить клетки путем лизиса (разрушения плазматической мембраны), высвободив клеточное содержимое. Причина, по которой необходимо подвергать клетки лизису, состоит в том, что антитела не могут пройти через плазматическую мембрану внутрь клетки. Конечно, вы не собираетесь убивать все бактерии, которые с таким трудом получили. Поэтому часть от каждой колонии бактерий нужно перенести на новые агаровые пластинки. Для этого поместите пленку над колониями бактерий. На этой пленке останутся представители каждой колонии, ориентированные точно так, как на исходной чашке Петри. Если затем прижать эту пленку к новой агаровой пластинке, на ней останутся бактерии с пленки, которые дадут начало колониям, полностью идентичным исходным. Новые клетки можно лизировать, не нарушая их ориентации на агаровой пластине, используя ряд стандартных методов. Вы инкубируете эти лизированные клетки с моноклональными антителами, чтобы определить, какие из колоний вырабатывают инсулин. Как только вы изолируете колонию бактерий, которая связывает антитела и, значит, содержит необходимый белок, можно культивировать идентичную колонию бактерий с исходной агаровой пластины в целях получения белка (рис. 7.7). Это шаг 9 на рис. 7.8.

Рис. 7.7. Отбор бактерий, в которых эспрессируется необходимый ген

Рис. 7.7. Отбор бактерий, в которых эспрессируется необходимый ген

Рис. 7.8. Полная схема процесса получения человеческого белка в бактериальной клетке

Рис. 7.8. Полная схема процесса получения человеческого белка в бактериальной клетке

Но как можно быть уверенными, что бактериальная клетка будет активно образовывать инсулин? В конце концов, каждая клетка в человеческом организме несет генетический материал, необходимый для синтеза инсулина. Однако только в клетках островков Лангерганса происходит экспрессия гена инсулина и образуется этот белок. Поэтому, если бактерии просто содержат ген инсулина, это еще не означает, что в них будет образовываться инсулин. И вы снова используете благоприятную возможность встроить ген в любое место на плазмиде, выбрав соответствующую рестриктазу, при условии что знаете последовательность генов на плазмиде.

Вспомним из главы 4, что гены считываются с помощью фермента, называемого РНК-полимеразой. РНК-полимераза узнает определенный участок ДНК, который как бы говорит: «Начинай!» Вы можете поместить ген непосредственно за сайтом связывания РНК-полимеразы с ДНК, то есть за точкой старта транскрипции, хотя в естественных условиях это точка старта транскрипции генов, кодирующих другие белки. Вспомним, что РНК-полимераза после связывания в точке старта синтезирует мРНК, пока не получит сигнал «стоп!». При этом ей совершенно «безразлично», какую последовательность она создает. Созданная мРНК отправится далее для участия в трансляции с целью создания нужного белка. Поэтому, если вы незаметно вставите определенную последовательность между точкой старта и точкой терминации, РНК-полимераза будет синтезировать мРНК для выбранного белка. Плазмиды, видоизмененные таким образом, называют векторами экспрессии, потому что они обеспечивают экспрессию гена, кодирующего нужный белок.

www.1001bilet.ua/2563-soblazn.html
Восковая эпиляция зоны бикини в салоне Мастер эпиляции.

Оставить комментарий

Ваш комментарий