Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов

Для определения генетического дефекта нужно знать, какой из генов затронут и где расположен этот ген. Мощным инструментом для определения пораженных генов и скрининга популяции людей на наличие измененного гена считается анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ).

В главе 12 мы писали, что ферменты, названные эндонуклеазами рестрикции, разрезают ДНК по специфичным последовательностям — сайтам рестрикции. Две молекулы ДНК будут разрезаны на фрагменты одинаковой длины, если молекулы идентичны. Но если в одной молекуле есть сайт рестрикции, а другой нет, то фрагменты будут различной длины. Если в одной молекуле будет больше пар оснований до сайта рестрикции, чем в другой, то фрагменты также будут различными и т.д.

На практике это означает, что, разрезая эндонуклеазами рестрикции часть генома двух индивидуумов одного вида, можно получить фрагменты различной длины, в зависимости от строения проверяемой части генома индивидуума. Это также значит, что при сравнении гомологичных районов обеих хромосом пары можно получить фрагменты различной длины. Такая картина наблюдается, если в хромосоме есть делеция, или где-нибудь между сайтами рестрикции существует инсерция — мутация, убирающая сам сайт рестрикции, а также если аллели генов различны между сайтами рестрикции.

ПДРФ наследуются по законам Менделя и представляются незаменимыми при определении генов наследственных болезней, например болезни Гантингтона. Ученые исследуют популяции с высокой частотой заболевания болезнью на наличие ПДРФ, наследуемого страдающими от болезни людьми, но не встречающегося у здоровых людей. Это хороший индикатор того, что ПДРФ расположен около гена болезни.

Например, ПДРФ помог установить точную локализацию гена фиброза мочевого пузыря (рис. 14.1). Как только расположение гена установлено, его можно клонировать, определить природу дефекта, вызывающего генетическую болезнь, разработать новые методы лечения.

ПДРФ позволил определить точное расположение гена фиброза мочевого пузыря

Рис. 14.1. ПДРФ позволил определить точное расположение гена фиброза мочевого пузыря

Анализ ПДРФ можно выполнить, имея очень небольшие количества ДНК из клеток белой крови или клеток плода, которые. также пригодны для использования в диагностике болезней. Зная о сцеплении определенного ПДРФ с геном наследственной болезни, можно устанавливать ее диагноз точно и быстро.

В редких случаях, которые очень удобны для проведения диагностики, мутировавший ген изменяет непосредственно ПДРФ. Например, при серповидно-клеточной анемии отсутствует сайт рестрикции в гене больных людей, но он есть в гене людей здоровых (рис. 14.2). В результате у нормальных клеток два фрагмента в ПДРФ, а у клеток больных людей — только один.

ПДРФ, расположенный в гене нормального гемоглобина, отсутствует в фамильном гене, вызывающем серповидно-клеточную анемию. Это позволяет ставить диагноз болезни, используя метод ПДРФ

Рис. 14.2. ПДРФ, расположенный в гене нормального гемоглобина, отсутствует в фамильном гене, вызывающем серповидно-клеточную анемию. Это позволяет ставить диагноз болезни, используя метод ПДРФ

Весь процесс использования ПДРФ для картирования, диагностики и определения дефектных генов сходен с приводимым ниже, использованным для раскрытия механизма, лежащего в основе мышечной дистрофии Дюшена:

  1. 1. Большие семьи, в которых встречается болезнь, проверяются на известные и картированные ПДРФ.
  2. 2. Результаты исследуются на наличие статистически значимых связей между наследуемыми ПДРФ и болезнью.
  3. 3. В случае успеха ген может быть картирован в специфическом участке определенной хромосомы. Если несколько известных ПДРФ окружают ген и расположены близко от него, ген можно клонировать.
  4. 4. Если нормальный ген клонирован, можно создать для него пробу и использовать ее для проверки библиотеки нормальных мышечных клеток.
  5. 5. Из библиотеки можно клонировать нормальный ген и другие последовательности ДНК, необходимые для его выражения.
  6. 6. Полученная ДНК может быть встроена в вектор и введена в Е. coli.
  7. 7. Е. coli синтезирует белок клонированного гена. Это белок нормального гена.
  8. 8. Тесты могут определить наличие или отсутствие белка у людей, страдающих болезнью. В случае болезни Дюшена было показано, что в организме не синтезируется белок, названный дистрофином. Причиной этого является мутация в гене дистрофина.

По аналогичной схеме проводятся исследования других плохо изученных генетических болезней.

Судебно-медицинская генетика

Косвенно эндонуклеазы применяются в судебно-медицинской генетике с целью установления идентичности ДНК, оставленной на месте преступления или взятой у преступника или жертвы преступления.

Получение ДНК-фингерпринтов (отпечатков) основано на том факте, что различные геномы человека обладают различным количеством тандемных (следующих друг за другом) повторов последовательностей ДНК. Каждая из них называется мини-сателлитом, или локусом с варьирующим числом тандемных повторов (локусом VNTR).

Количество, длина и порядок этих повторяющихся последовательностей ДНК уникальны для каждого человека. Но независимо от длины последовательности, она содержит общее для последовательностей ядро (менее 20 пар оснований в длину), которое узнается соответствующей пробой.

ДНК из образца, взятого на месте преступления, из клеток подозреваемого в преступлении или клеток жертвы преступления разрезается одной или несколькими эндонуклеазами рестрикции, затем помещается в гель для электрофореза, где фрагменты ДНК разделяются. Далее фрагменты денатурируются до отдельных нитей, переносятся на нитроцеллюлозный фильтр и обрабатываются радиоактивной пробой ДНК, после чего делается авторадиография. Количество полос, определяемое на авторадиограммах, уникально для каждого человека.

Металлочерепица в санкт петербурге ООО "Кровельный МИР".
Шланг газовый металлорукав www.metallo-rukav.ru.

Оставить комментарий

Ваш комментарий