Секвенирование ДНК

Метод Зангера — терминация цепи, или (дидезокси-метод, используемый для секвенирования (определения последовательности оснований) ДНК, начинается с синтеза однонитевой цепи ДНК, подлежащей секвенированию, измененной добавлением радиоактивного маркера, который всегда расположен на ее конце. Затем готовятся четыре различные смеси, каждая из которых содержит не только все нуклеотиды, необходимые для репликации ДНК, но и небольшое количество нуклеотидов, которые связываются с нитью ДНК, после чего другие нуклеотиды перестают с ней связываться. В каждую смесь включают только одни вид модифицированных нуклеотидов {дидезоксинуклеотидов). Каждый из дидезоксинуклеотидов вызывает остановку (терминацию) синтеза любой цепи ДНК, включающей его, у специфического основания.

В каждой из четырех смесей в результате образуются нити различной длины (длина определяется местом, где — и если — в нить включается дидезоксинуклеотид), каждая нить заканчивается одним и тем же основанием, и все они помечены радиоактивной меткой.

В геле с помещенными в него электродами отрицательно заряженная ДНК движется к положительно заряженному электроду, или аноду. При этой методике, электрофорезе, короткие фрагменты ДНК движутся быстрее, а длинные — медленнее. Поскольку ДНК несет радиоактивную метку, она может засвечивать фотографическую пленку. Как только ДНК распределится на фрагменты, от самых коротких до самых длинных, результаты могут быть сфотографированы как серия полос, каждая из которых отмечает место в последовательности оснований ДНК (ДИК-секвепс), где расположено определенное основание.

Метод Максама-Гилберта

Почти в то же время, когда Зангер предложил свой метод секвенирования ДНК, Уолтер Гилберт (Walter Gilbert) из Гарвардского, университета и студент-выпускник Алан Максам {Allan Maxam) разработали альтернативный метод, за который Гилберт в 1980 году разделил Нобелевскую премию с Зангером.

Тогда как метод Зангера основан на работе ферментов, в методе Максама — Гилберта были использованы химические вещества, которые действовали на одни основания больше, чем на другие, что приводило к разрывам в местах ДНК, где встречались эти основания.

Метод Зангера, однако, оказался более легким и популярным, чем метод Максама — Гилберта, и почти вытеснил его.

Поставив рядом гели после электрофореза и сравнивая расположение полос, полученных в каждой из четырех смесей, можно прочитать полное основание нити ДНК (рис. 6.1). В июле 1984 года, через семь лет после опубликования своего нового метода секвенирования ДНК, Зангер и его коллеги по британскому совету медицинских исследователей закончили определение полной последовательности ДНК вируса Эпштейна — Барра. Это вирус из группы герпеса, он вызывает инфекционный мононуклеоз. Была секвенирована последовательность длиной в 5375 нуклеотидов. Это был не только полный геном вируса (или любой иной), составленный впервые, но и самая длинная последовательность ДНК на то время. Эта последовательность также продемонстрировала возможность перекрытия генов на нити ДНК и, соответственно, совместного использования различными генами одних и тех же фрагментов кода.

Рис. 6.1. ДНК может быть секвенирована за счет сравнения результатов четырех реакций, каждая из которых создает фрагменты, кончающиеся одним из четырех оснований

Рис. 6.1. ДНК может быть секвенирована за счет сравнения результатов четырех реакций, каждая из которых создает фрагменты, кончающиеся одним из четырех оснований

Работа также продемонстрировала, какой устрашающей могла оказаться задача расшифровки полного генетического кода любого из больших организмов. Если вирусная ДНК была длиной 5375 оснований, то какой же длиной могла оказаться человеческая ДНК?

Ответ: более 3 млрд оснований. В табл. 6.1 сравниваются величины геномов нескольких различных организмов: от вируса до человека.

Размеры генома у различных организмов

Размеры генома у различных организмов

Вакансии и работа менеджер по продаже металлопроката.

Оставить комментарий

Ваш комментарий