Векторы

По определению векторы направляют рекомбинантную ДНК в интактные клетки. Для введения небольшого количества ДНК в прокариотические клетки обычно используют плазмиды, и этот процесс совершается при обработке хлоридом кальция, как было описано выше. Данная система работает очень хорошо для небольшого количества генетического материала. Тем не менее для больших генов необходимы другие векторы.

Вирусы в данном случае — привлекательная альтернатива. Вирусы не были включены в обсуждение типов клеток, потому что не являются клетками. Они представляют собой небольшие отрезки ДНК, заключенные в капсулу. Их единственная функция — самовоспроизведение. Они не синтезируют белки и не проявляют других свойств, типичных для настоящей клетки, но самовоспроизводятся, используя механизмы репликации ДНК клетки-хозяина. Вирусы встраивают свою ДНК в клетку-хозяина. Обычно вирусная ДНК встраивается в ДНК хозяина, и когда ДНК клетки-хозяина реплицируется, одновременно реплицируется и ДНК вируса. Другой тип вирусов, называемый ретровирусами, содержит РНК и образует ДНК, только когда внедряется в клетку. Они могут не встраиваться в ДНК хозяина. К несчастью, вирусные частицы после репликации ищут пути выхода из клетки-хозяина, обычно путем лизиса клеток. Если бы вам удалось вставить ДНК в вирус, то вирус, делая то, что он обычно делает, внедрился бы в ДНК клетки-хозяина, и в клетке-хозяине образовывался бы нужный вам белок. Но в то же время необходимо предотвратить лизиз клетки под действием вируса, который внедрил ДНК в клетку.

Вирусы, которые паразитируют на бактериях, называют бактериофагами, или просто фагами. Бактериофаги используют как векторы, если ген нужно транспортировать в бактерию, и он слишком большой, чтобы быть перенесенным с помощью плазмиды. У фагов есть один существенный недостаток: их генетический материал встраивается в ДНК бактериальной клетки произвольно. Вспомним, что в случае с плазмидой вы можете определять, куда вставить новый ген. Кроме того, вы должны создать определенную среду в клетке, чтобы вирус не индуцировал лизис клетки. Тем не менее фаги широко используются для внесения нового генетического материала в бактериальную клетку-хозяина.

Вирусные векторы также применяют в экспериментальной генной терапии при лечении людей. Человеческие вирусы внедряют новую ДНК в человеческие хромосомы. Вы можете ввести ген, кодирующий новый белок, в человеческую клетку, используя этот метод. Преимущества обеспечения человека новым генетическим материалом при лечении болезней, связанных с генными нарушениями, будут обсуждаться подробно в главе 10.

Размещение генетического материала особенно важно при генетических экспериментах, проводимых с больными людьми. Вы можете непреднамеренно нарушить последовательность в гене, который кодирует очень важный белок, или создать ген, стимулирующий развитие рака. Ученые очень озабочены тем, что вставка нового генетического материала в определенные участки человеческой ДНК может привести к раку, поскольку две очень юные жертвы острой комбинированной иммунной недостаточности после генной терапии заболели лейкемией. Больные острой комбинированной иммунной недостаточностью получали лечение с использованием вектора из ретровируса. Такие вирусы могут встраиваться в человеческую ДНК, чтобы осуществлять свое действие. Вектор, использованный в экспериментальных попытках вылечить больных гемофилией и кистозным фиброзом, получают из аденоассоциированного вируса. Этот вирус с меньшей вероятностью будет встраиваться в ДНК клетки-хозяина и может быть столь же эффективным, как плазмида. Тем не менее недавние исследования показали, что он также может встраиваться в ДНК хозяина и по неизвестным причинам с большей вероятностью встраивается в гены, чем в некодирующие участки ДНК. Сторонники генной терапии отмечают, что существуют лишь ограниченные случаи, когда заражение природными вирусами, встраивающимися в ДНК хозяина, предопределяет развитие рака, и что пациенты, проходящие генную терапию, поражены угрожающими жизни болезнями с ограниченными возможностями лечения. Ученые ищут векторы, которые встраиваются по определенным известным последовательностям или вовсе не встраиваются в ДНК клетки-хозяина. На текущий момент есть возможность использовать эндонуклеазы, чтобы руководить вставкой вектора в ДНК хозяина, или задействовать искусственные хромосомы, которые остаются отдельно от ДНК хозяина (см. следующий раздел).

Цинковые эндонуклеазы — это ферменты, естественным образом существующие в клетках, которые разрезают ДНК в определенных точках. Эндонуклеазы могут иметь два или три «пальца». Эти «пальцы» — участки, в которых эндонуклеаза связывается с «обреченной» ДНК. Если в эндонуклеазе два «пальца», она связывается в двух точках, и сайт связывания каждого «пальца» — это определенная специфичная последовательность ДНК. Если молекула эндонуклеазы имеет три «пальца», в ней есть три сайта связывания со специфическими последовательностями. «Трехпальцевая» эндонуклеаза является ферментом с более ограниченной областью действия. В экспериментах, где использовали «двухпальцевые» эндонуклеазы, чтобы повлиять на место вставки нового генетического материала, встраивание происходило в нужной области только в небольшом проценте случаев. Недавние исследования показали, что использование «трехпальцевых» эндонуклеаз дает значительно более высокий процент генных вставок в заданной области.


Оставить комментарий

Ваш комментарий