Встраивание человеческого гена в бактериальную ДНК

Вы хотите встроить ген инсулина в бактерию, потому что бактерия будет синтезировать человеческий белок в форме, которую с меньшей вероятностью отторгнет иммунная система реципиента по сравнению с инсулином, полученным из животных. Кроме того, процедура получения инсулина из бактериальной колонии намного дешевле, чем содержание больших животных, которых раньше использовали для его получения. При попытке вставить человеческий ген в бактериальную ДНК могут возникнуть следующие проблемы:

- сложно внедрить ДНК в клетку. Нужен вектор, который будет транспортировать ДНК в клетку;

- попав в клетку, человеческая ДНК будет опознаваться бактерией как чужеродная, основываясь на том факте, что бактериальная ДНК кольцевая, а человеческая — линейная. Бактерия будет уничтожать чужеродную ДНК. Поэтому необходимо вставить человеческую ДНК в кольцевой форме.

Большинство бактерий имеют одну кольцевую хромосому. К счастью, у них также есть небольшие дополнительные отрезки ДНК, называемые плазмидами. Как показано на рис. 7.2, плазмиды — это небольшие кольцевые структуры, которые существуют независимо от главной хромосомы бактерии. Обычно они содержат менее 5% информации и не содержат жизненно важной информации, нужной клетке для выживания. В плазмидах присутствует несколько генов, отвечающих за выживание в экстремальных условиях среды. Все это очень хорошо подходит для вашей цели, так как плазмиды могут служить векторами.

Рис. 7.2. Плазмиды

Рис. 7.2. Плазмиды

Плазмиду можно разрезать с помощью ферментов-рестриктаз, получив тем самым линейную ДНК. Вместе с открытием обратной транскриптазы, открытие рестриктаз, которые в норме существуют в бактериальной клетке, было решающим для развития генной инженерии. Первую рестриктазу выделили из бактерии и охарактеризовали Г.О. Смит (Н.О. Smith), К. Уилкокс (К. Wilcox) и Дж.Дж. Келли (J.J. Kelly) в 1968 году. Такие белки, в норме присутствующие в клетках, разрезают молекулы ДНК по определенным последовательностям азотистых оснований. Это четвертая ступень в процессе, описанном на рис. 7.8.

Для чего у бактериальной клетки есть ферменты, разрезающие на части молекулу ДНК? Наличие этих ферментов выгодно для бактерии, так как они защищают ее от бактериофагов — вирусов, которые атакуют бактерии. Когда вирусная ДНК вводится в бактерию, она подвергается атаке рестриктаз и уничтожается. Собственная бактериальная ДНК защищена от рестриктаз присутствием уникальных метальных групп на парах азотистых оснований. Эти метальные группы предотвращают взаимодействие с рестриктазами, которых в настоящее время идентифицировано более 900. Каждый фермент имеет свой специфический активный центр. Известно более 200 уникальных последовательностей ДНК, которые узнаются различными рестриктазами. Рестриктазы специфичны к последовательностям из десяти нар оснований в ДНК. На примере, показанном на рис. 7.3, рестриктазы разрезают ДНК между парами оснований Г-Ц и Т-А.

Рис. 7.3. Рестриктазы

Рис. 7.3. Рестриктазы

Вы можете разрезать плазмиду, где пожелаете, подобрав рестриктазу, которая разрезает ДНК плазмиды по выбранной последовательности оснований. Более того, вы знаете, что если разрежете ДНК с помощью рестриктаз, то по краям останутся так называемые «липкие концы». Это происходит, поскольку рестриктаза оставляет рваный или зубчатый край. Концы не являются липкими буквально, но они содержат короткие фрагменты одноцепочечной ДНК. Эти фрагменты будут с легкостью соединяться с новой ДНК, содержащей комплементарные последовательности оснований. На рис. 7.3 «липкие концы» состоят из фрагментов Г-А-Т-Т на одном конце и Ц-Т-А-А на другом конце. Эти концы будут «приклеиваться» к фрагментам Ц-Т-А-А и Г-А-Т-Т соответственно. Между «липкими концами» можно добавить дополнительные пары оснований. Вы можете выделить плазмиды из бактерий и использовать рестриктазы, чтобы проделать дырку в бактериальной плазмиде, а затем «вклеить» туда необходимый ген.

Также необходимо создать «липкие концы» на гене, используя соответствующую рестриктазу. Выбирая рестриктазу, вы выбираете нуклеотиды, которые будут находиться на «липких концах» разорванной ДНК. Но что если ген, который вам нужен, не имеет совместимых «липких концов», которые бы соединялись с разорванной плазмидой? Индустрия биотехнологии предвосхитила ваше желание и создала набор из небольших отрезков ДНК, который содержит всевозможные последовательности, подходящие для комплементарного связывания с «липкими концами». Их можно добавить к вашему гену, используя фермент ДНК-лигазу. Это третий шаг, изображенный на рис. 7.8. Теперь вы можете встроить ген в плазмиду и создать рукотворную рекомбинантную ДНК, как показано на рис. 7.4. Это пятый шаг на рис. 7.8. Вспомним, что вы начали с мРНК островковых клеток, потому что они образуют большое количество инсулина, а вы пытаетесь получить ген инсулина.

Рис. 7.4. Встраивание ДНК в бактериальную плазмиду или создание рекомбинантной ДНК

Рис. 7.4. Встраивание ДНК в бактериальную плазмиду или создание рекомбинантной ДНК

Большой процент (но не все) генов, созданных на основе полученной ранее мРНК, будет действительно генами, кодирующими инсулин. В некоторые из плазмид встроится ген инсулина. Тем не менее островковые клетки синтезируют также ряд других белков, и некоторые из полученных генов будут кодировать эти белки. На этом этапе вы не сможете отобрать только гены, которые кодируют инсулин. Поэтому после инкубации часть плазмид будет содержать другие гены, а некоторые плазмиды не будут содержать вообще никакого нового генетического материала. И вы не можете различить эти плазмиды. Теперь вы встраиваете все плазмиды, лишь часть из которых содержит ген интереса, в популяцию бактерий. Бактерии прошли определенную стимуляцию с помощью обработки раствором хлорида кальция, что позволит плазмидам попасть внутрь. Такой процесс называют трансформацией. Это шаг 6 на рис. 7.8.

http://ok-sender.com/ скачать ок - зона загрузки одноклассники скачать.

Оставить комментарий

Ваш комментарий